Jan Rozehnal studierte Flöte am Konservatorium in Kroměříž (Kremsier) sowie Orchesterleitung an der Janáček-Akademie für Musik und Darstellende Kunst in Brünn bei Otakar Trhlík und Lubomír Mátl. Zwei Praktikumsjahre bei der Czech Philharmonic ergänzten seine Ausbildung.
Während seines Studiums in Brünn gründete er den Brno Youth Choir, mit dem er einige Preise bei internationalen Wettbewerben gewann. Nach seinem Studium arbeitete er als Assistent von Lubomír Mátl bei der Choral Society of Moravian Teachers und wurde später der Dirigent dieser Institution.
Er begann seine Laufbahn als Dirigent am Südböhmischen Theater in České Budějovice (Budweis) und war später der Leiter des Philharmonischen Chores in Brünn "Beseda brněnská", der eng mit dem Brünner Philharmonischen Orchester zusammenarbeitet.
Von 1990 bis 2003 war er als Chorleiter des Slowakischen Philharmonischen Chores tätig, mit dem er zahlreiche erfolgreiche Projekte auf heimischen und internationalen Bühnen realisierte. Während seiner Zeit in der Slowakei gründete er die Camerata Bratislava, ein Vokalensemble für die historische Aufführungspraxis Alter Musik. Das Ensemble gewann den Diapason dʼor und den Preis des Ministerpräsidenten der Slowakischen Republik.
2004 zog Jan Rozehnal nach Prag, wo er bist 2008 der Leiter des Kühn Mixed Choir und des Philharmonischen Chores war. Von 2008 bis 2023 wirkte er als Chorleiter und Dirigent in Deutschland, zunächst in Koblenz, später in Frankfurt und in Halberstadt. Mit Beginn der Saison 2023/24 wurde er erneut zum Leiter des Slowakischen Philharmonischen Chores berufen.
Im Laufe seiner Karriere war er an verschiedenen Produktionen und Aufnahmen für namhafte Musiklabels beteiligt, darunter Decca, Deutsche Gramophon, Discovery, Harmonia Mundi, Marco Polo, Naxos, NBC und Slovart). Er hat mit sehr berühmten Ensembles und Dirigenten zusammengearbeitet, so um Beispiel mit Claudio Abbado, Riccardo Chailly, Christoph von Dohnányi, Kurt Masur, Zubin Mehta, Georges Prêtre und Ralf Weikert.